就临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
技术动态发布时间：2023-02-10
最近几年2代基因测序技术快速发展，其利用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。
国内外有关学会已出台相干共鸣与指南以推动其在临床中的利用。中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病价格上涨理专委会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范NGS在份子病理领域的利用。
临床份子病理实验室NGS样本可采取甲醛固定石蜡包埋组织、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。本共鸣特点是基于病理评估的组织样本的规范。测序分析范围基于目前临床需求，本共鸣侧重在于目标区域测序分析的实践。随着技术的更新和利用的成熟，本共鸣将延续更新以满足临床需求。
1、实验室整体要求
NGS检测实验室的整体设计与要求应参考《份子病理诊断实验室建设指南》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化医治检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测利用技术指南》进行。
1.NGS检测人员的资质要求：NGS检测技术人员应具有临床病理学、份子生物学的相干专业大专以上学历，并经过NGS技术的理论与技能培训合格。数据分析人员应具有临床医学或份子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或授权签字人审核。
2.NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂贮存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域、文库扩增区、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区。各工作区空气及人员流向需要严格依照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开。
3.NGS检测试剂及项目要求：试剂和测序平台均应选择中国食品药品监督管理总局认可产品。触及到实验室自配试剂，应当有严格的试剂制备标准操作规程，需经过临床实验室自建项目验证合格才可以使用。每一个NGS检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和分析工具和不同的突变类型包括，单碱基突变single nucleotidevariant，SNVs、小片断插入或缺失、基因拷贝数变异Copynumber variations、染色体结构变异，structuralvariation和不同的样本类型对特定panel的准确性、性、敏感性、特异性等性能参数进行LDT验证。应当有经过标准品测试的在不同的mutant allele frequencies下，不同测序深度的灵敏度及特异性数据，肯定不一样本的可信的测序深度。经验证后，SOP产生的任何改动，包括试剂、仪器、基因项目等都需要重新做验证。验证实验结果签名留底备案。
4.NGS检测实验室的质量管理要求：NGS检测主要包括实验操作和生物信息学分析两部份。实验操作部份包括样本准备、文库制备、编码、目标区域富集、测序等;生物信息学分析部份包括定位、比对、变异辨认、变异注释、变异解读及报告等。上述流程均需要建立实验室质量管理体系文件和SOP及机器运行和保护SOP，具有严格的室内质控措施;定期参加室间质评以有及延续的质量保证和改进计划。
2、NGS分析样本、基因panel和转运要求
NGS分析样本类型可采取FFPE样本、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。
对肿瘤体细胞变异初次NGS检测应经病理评估的组织样本，在此数据基础上的再次检测可选取液体样本动态监测。
NGS检测前需通过病理诊断明确其肿瘤的性质及含量，根据不同肿瘤类型选择适合的基因panel测序。
不同疾病的基因panel列表，必须由临床与检测机构的专家共同决定，已到达不同实验室之间的可比性和完善性。
未经病理评估的基因检测结果不可单独用于份子病理临床诊断目的。
样本质量对检测结果和分析相当重要，病理医师需要对可评估的样本进1步明确病理诊断，并评价标本有没有出血、坏死和不利于核酸检测的前处理，病变细胞的总量和比例，避免假阴性。组织标本中肿瘤细胞含量建议到达20以上，低于此标准可富集后检测。
NGS检测实验室应对不同类型的样本有收集及处理SOP指点。对不同的样本实验室应有不同的样本运送SOP，物流环节应有相干运送记录，确保样本运送安全、无污染、无降解。
3、NGS检测流程中的质量标准
1.核酸提取及其质量分析：提取的核酸质量是NGS检测成功的关键因素，在制备文库前应采取多种方法对核酸质量评估，包括纯度、浓度和完全性分析。需要根据不同的样本类型制定相应的SOP用以鉴定核酸的纯度、浓度、完全性或降解程度等。并对应明确接受和谢绝的标准。
2.文库制备及其质量分析：文库制备方法主要有杂交捕获和扩增子建库，不管采取何种方法制备文库和平台检测，都应对检测基因、区域或突变热门进行描写，并建立实验室检测SOP。建立好文库后上机测序前需对文库进行质量分析。每一个检测项目应设定其文库质量的要求，明确接受或谢绝的标准。
3.NGS测序仪上机分析及其质量分析：NGS建库主要有扩增法和捕获法两大策略，测序时根据检测样本量和质量要求肯定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。录入样本编号、检测内容、设定参数等信息，按仪器操作流程进行测序。产生的测序数据质量参数要求详见后文。
4.NGS检测中的样本追踪及对比设置：样本追踪：为确保检测进程中最后木质素产生分解样本没有混淆或污染，可选用多个SNV位点或其他标签作为样本身份标识，在检测前对每一个样本进行SNV位点信息的测定，在NGS检测后对上述位点进行追踪，证明没有交叉污染。阳性对比：利用组合型质控材料，可采取已知突变信息的混合样本，以摹拟样本的复杂性。实验时同时检测，以确保其检出能力。阴性对比：用无核酸或明确无突变的样本作为模板同时进行检测，以确保检测进程中没有污染或非特异性。应对方案和替换方法：各个质量控制步骤中如出现异常或失败，实验室应有应对措施或备选方案;对测序结果质量差或有问题的区域应建立替换方法。
4、生物信息分析
NGS数据的生物信息分析可分为两个主要步骤：1是对测序数据进行质控分析及过滤。2是对通过质控的序列进行变异位点鉴定分析并注释。所用各种生物信息分析软件，都要通过适当标准品测序数据进行验证，证明所用软件及参数可到达临床报告的要求。
1.NGS生物信息分析流程标准：质控分析：为保证分析结果的可靠性，需要对原始的测序数据进行质量控制与过滤。测序数据的质量控制主要包括4个方面：质量评估、去接头序列、去低质量序列、去重复序列。序列比对：将通过质控后每条read与参考基因组进行比对，回贴到基因组上佳位置。变异鉴定：对每一个位点进行变异鉴定。在肿瘤panel测序中，主要检测SNV和Indel两种突变类型，参数调剂后可分析CNV。部份panel的设计还可以鉴定染色体易位。对肿瘤panel基因测序数据，鉴定后的变异位点都需要进行该位点可视化查看和确认，如The IntegrativeGenomics Viewer 。变异注释：基于通用数据库，对突变基因位点进行功能注释，详见下文。
2.NGS生物信息分析流程质量管理：实验室应建立生物信息学程序/Pipeline的书面质量管理 计划文件。必须包括每次运行时监测和评估运行性能的指标和质控参数，和定期监测的指标和质控参数。指标和质控参数可包括但不限于标准品的突变类型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采取已知变异类型和变异频率的标准品进行验证，验证其特异性和灵敏度是不是到达实验室要求。验证结果签名留底备案。NGS数据存储：实验室需要在生物信息分析进程中对原始数据及后的结果数据进行标准化存储，并要保存相应的年限以备查。版本可追溯性：每份病例数据分析报告中，生物信息数据分析流程所触及软件、算法、参数及数据库的版本必须可溯源。异常记录。实验室需要建立符合两国和两国人民根本利益1个异常记录文档，用来记录偏离NGS生物信息分析标准分析流程的检测。
3.NGS生物信息分析质量指标：原始文件及比对结果文件的质量指标见表1。
4.NGS数据存储格式标准：为了规范和管理各类数据，各个实验室需依照编号进行数据管理，所有数据依照国际标准格式进行存储。必须建立本地变异数据库。
5.NGS数据存储传输及同享安全标准：实验室需要制定规章制度以确认测序数据在内部及外部存储及传输进程中的安全性和机密性。正常人群的变异数据应当同享。
5、NGS结果解释及报告
1.NGS临床报告包括内容：基于高通量测序技术，临床实验室比较容易的获得更高通量的临床样本检测数据，不可避免会检测到意义未知的变异位点，在实际工作中会有1定的不肯定性。但NGS的检测报告建议体现以下内容：
检测名称，如XXX基因变异检测报告。
患者基本信息，姓名，年龄，性别，住院号，送样医院科室及医师等。
样本信息，病理号，取材部位，样本类型、送检日期、报告日期等。
病理信息，肿瘤组织类型、位置、TNM分期、细胞含量、肿瘤细胞比例、特殊说明。
检测技术，包括所用基因panel、检测平台名称，分析软件版本号等。
结果列表应包括，基因名称、变异在染色体位置、变异频率、cDNA的Genbank号及符合人类基因组变异协会书写规范的突变类型、编码蛋白Genbank号及突变类型、杂合/纯合状态等。
临床意义解读和批注：体细胞突变，报告各个肿瘤检测到的变异位点及临床意义。胚系突变，对检测到的变异位点的致病性予以相应的临床解释。临床意义解读要客观平实的描写，在疾病相干性只描写既往研究中的疗效或预测，不能出现使用何种医治手段或策略的语言。
若检测失败，应论述失败缘由。
终报告应由检测者、报告医师或指定审核人联合签发。
2.基因变异的命名：在描写所检测出的基因变异时要遵守1定的原则和规范，推荐使用人类基因组变异协会命名指南。对遗传病相干基因变异命名，推荐美国医学遗传学学院的遗传疾病变异分类指点的命名、遗传背景说明和文献说明。
3.临床意义的解读和批注：对肿瘤体细胞突变，根据突变的类型和已有的报导及指南，基因变异提倡分级的处理方式：
A级：美国食品药品管理局或中国食品药品管理局批准的用药医治靶点;写入中外诊疗指南有明确诊断/医治/预后意义的变异。在报告注释该变异位点的临床诊断/医治/预后意义的指南国际1些知名塑料行业生产巨头如法国Albea、PP薄膜生产商Flexpol、PU泡沫塑料生产商Greiner Multifoam均在波兰经济特区设有生产工厂来源。
B级：还没有进入诊疗指南，但已写入该领域的专家共鸣的变异位点。注释时要批注研究报导及专家共鸣的来源，明确其药物及其临床意义、正在展开的状态等信息。
C级：FDA或CFDA批准用于其他肿瘤可预测疗效的基因变异，或正在进行中的临床实验变异位点。注释时要批注用于其他肿瘤的指南，研究文献及临床实验正在展开的状态等信息。
D级：处于学术争议或临床意义不明确的基因变异。同1实验室应当有统1的政策用来应对检测进程中出现的临床意义不明变异情况。
对以上几种情况在报告的时候注意客观平实地描写检测的结果，在病理报告中不能出现建议使用何种医治手段或策略的语言。
对遗传疾病检测，除中外诊疗指南及重要参考文献之外，推荐两个数据库：Online Mendelian Inheritance in Man 和美国医学遗传学学院的遗传疾病变异分类指点注释临床意义，并附上数据库和参考文献内容。遗传注释还可以参考各亚专科的专业数据库进行注释。
4.意义不明位点的处理：由于通量的增加和人种差异，临床肿瘤样本可能发现新的变异位点。实验室必须制定相干政策方案用来应对检测进程中出现的临床意义不明变异情况。政策可以是1发现变异就报告，但附上说明和意义。也能够是不报导这些发现或只报导小部份变异结果，并附上说明和参考文献及数据库。但是在报告的备注里1定要声明本实验室的报告规则。
5.知情同意：建议提供患者手写或在线版的知情书。